若在待测样品中加入已知起始拷贝数的内标，则pcr反应变为双重pcr，双重pcr反应中存在两种模板之间的干扰和竞争，定量pcr仪，尤其当两种模板的起始拷贝数相差比较大时，pcr仪，这种竞争会表现得更为---。但由于待测样品的起始拷贝数是未知的，所以无法加入合适数量的已知模板作为内标。也正是这个原因，传统定量方法虽然加入内标，但仍然只是一种半定量的方法。
将标记有荧光素的taqman探针与模板dna混合后，完成高温变性，实时荧光定量pcr仪，低温复性，适温延伸的热循环，并遵守聚合酶链反应规律，与模板dna互补配对的taqman探针被切断，进口pcr仪，荧光素游离于反应体系中，在特定光激发下发出荧光，随着循环次数的增加，被扩增的目的基因片段呈指数规律增长，通过实时检测与之对应的随扩增而变化荧光信号强度，求得ct值，同时利用数个已知模板浓度的标准品作对照，即可得出待测标本目的基因的拷贝数。
在pcr反应早期，产生荧光的水平不能与背景明显地区别，而后荧光的产生进入指数期、线性期和终的平台期，因此可以在pcr反应处于指数期的某一点 上来检测pcr产物的量，并且由此来推断模板初的含量。为了便于对所检测样本进行比较，在real-time q-pcr反应的指数期，首先需设定一定荧光信号的域值，一般这个域值（threshold）是以pcr反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号 （baseline），荧光域值的缺省设置是3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。
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