1. 模板---模板(靶基因或样品dna)---的量与纯化程度是pcr成败与否的关键环节之一。一般---检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，---除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于pcr扩增。dna模板提取一般采用异---胍或蛋白酶k法，要防止核糖---酶(ribonuclease，rnase)降解rna。2. 引物pcr产物的特---取决于引物与模板dna互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板dna序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链作引物。每条引物链的浓度为0.1~1μmol或10-100pmol，以反应所需要的低引物量的浓度为好。3. dna聚合酶taqdna聚合酶基因全长2496个碱基，75~80℃时每个酶分子每秒钟可延伸约150个核苷酸，pcr仪，在pcr循环的高温条件下仍能保持较高的活性和---的热稳定性，温度过高(90℃以上)或过低(22℃)都可影响taqdna聚合酶的活性。目前，小型pcr仪，有两种taqdna聚合酶供应，一种是从栖热水生中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶
将标记有荧光素的taqman探针与模板dna混合后，实时荧光定量pcr仪批发，完成高温变性，低温复性，pcr检测仪，适温延伸的热循环，并遵守聚合酶链反应规律，与模板dna互补配对的taqman探针被切断，荧光素游离于反应体系中，在特定光激发下发出荧光，随着循环次数的增加，被扩增的目的基因片段呈指数规律增长，通过实时检测与之对应的随扩增而变化荧光信号强度，求得ct值，同时利用数个已知模板浓度的标准品作对照，即可得出待测标本目的基因的拷贝数。
实时荧光定量pcr仪，由荧光定量系统和计算机组成，用来监测循环过程的荧光。与实时设备相连的计算机收集荧光数据。数据通过开发的实时分析软件以图表的形式显示。原始数据被绘制成荧光强度相对于循环数的图表。原始数据收集后可以开始分析。实时设备的软件能使收集到的数据进行正常化处理来弥补背景荧光的差异。正常化后可以设定域值水平，这就是分析荧光数据的水平。
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